第一步：设计流式细胞实验

流式对照至少有 5 种，包括生物学对照，空白对照，同型对照（Isotype control），补偿对照（也叫单阳性对照）和 FMO 对照，主要目的是为了避免出现的假阳性或假阴性结果。

第二步：细胞悬液样本制备

流式细胞术的分析检测建立在单个细胞的基础上，所以制备合格的单个分散的细胞悬液是非常关键的一环。

流式细胞悬液样本制备步骤：

（1）制备活性高的单细胞悬液：用胰酶消化细胞，PBS 清洗2~3次，主要去除胰酶，然后使用完全培养基将细胞调整为5x10^6-5x10^7个/ml即得待检样本

（2）取40ul细胞悬液加入预先有特异性McAb（5~50ul）的小玻璃管或塑料离心管，再加 50u1:20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清，置于4℃ 30min

（3）用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右，1000rpm离心5min

（4）弃上清，加入50ul工作浓度的羊（或兔）抗鼠荧光标记物，充分振摇，4℃，30min

（5）用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右，1000 rpm离心5min

（6）加1ml固定液制成流式细胞仪标本

第三步：流式检测操作流程

流式细胞仪的使用一般分为仪器前阶段、流式细胞仪阶段和结果分析阶段。

（1）仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色，其中细胞样本准备操作步骤如下：

1. 单细胞悬液的制备：将1x10^5~1x10^7的细胞放入1.5 ml离心管中3000r/min离心5min，弃上清；加入FACS缓冲液100ul悬浮细胞

2. 封闭细胞表面Fc受体：在步骤1中加入Fc受体抗体0.5 ul（0.5mg/ml），水浴3分钟

3. 细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1ul（0.5mg/ml），水浴30分钟

4. 洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350ul，轻轻混匀，3000r/min，离心5分钟，弃上清，2次重复步骤4

5. 上样前处理：取100ul仪器缓冲液加入步骤4获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞将细胞悬液移入FACS专用管中准备进行仪器检测和分析

（2）流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作，包括以下步骤：

仪器的操作：

1. 使用前的准备

①打开电源：包括系统电源和主机部分电源，指示灯变绿

②检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净

③使机器处于负亚状态，使细胞悬液被吸入至机器的吸管口

使用中的操作：

1. 计算机部分&mdash；使用CellQuest程序系统软件

①设定所要检测细胞的数量：一般设10000~20000个细胞

②命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期

③打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间

④将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测

⑤主机设定：一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件包括探测器的电压。探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围

⑥选择检测的波长和表达方式（plot）：如果用一种荧光抗体一般选直方图（histogram）；如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dotplot）或轮廓线图（contourplot）表

2. 细胞的吸入：将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。所有的数据将自动存入微机。

3. 使用后的清洗：

①将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1min

②将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1min

③再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5min；再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟

④同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5min

⑤最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后，关闭机器

⑥将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽

注意事项：

1. 减少非特异荧光染色

细胞的活性和状态：流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。

2. 封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。

3. 单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。

4. 如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。

第四步：流式检测结果分析

实验结果图通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等。由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。

文章出自：验外实包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/